KURVA PERTUMBUHAN

Pertumbuhan

            Pertumbuhan adalah bertambahnya tinggi atau berat suatu organisme. Pertambahan tinggi maupun berat organisme merupakan bertambahnya ukuran sel atau bertambahnya jumlah sel. Dalam dunia mikroba pertumbuhan diartikan sebagai bertambahnya jumlah sel. Hal ini karena mikroba sebagian besar adalah organisme bersel tunggal. Sehingga difinisi pertambahan tinggi maupun berat organisme tidak berlaku lagi. Mikroba memperbanyak diri melalui pembelahan sel maupun reproduksi seksual. Reproduksi seksual hanya dijumpai pada mikroba bersel banyak seperti jamur.

Pembelahan Sel

            Terdapat 2 jenis pembelahan sel yaitu pembelahan biner dan pertunasan (budding). Pembelahan biner adalah pembelahan yang menghasilkan 2 sel sama besar (Gambar 3.1), sedangkan pertunasan adalah pembelahan yang menghasilkan 2 sel yang tidak sama besar (sel yang besar disebut induk dan sel yang kecil disebut anak). Pada jamur terdapat suatu deviasi dari pembelahan biner yang disebut pembelahan filamentus. Pembelahan atau pertumbuhan filamentus adalah pembelahan sel filamen (sel tubulus dan panjang), di mana hasil pembelahan tidak terpisah melainkan tetap menjadi suatu bagian utuh organisme tersebut. Hal ini masuk akal karena jamur merupakan mikroba bersel banyak. Pada bagian ini pembelahan sel yang dipelajari adalah pembelahan biner. Hal ini karena bakteri sebagian besar melakukan pembelahan biner dalam pertumbuhannya.

Pembelahan (Biner) Sel

Pada pembelahan (biner) sel akan memperbesar ukurannya mencapai ukuran ideal untuk pembelahan sel. Selama proses pertambahan ukuran sel terdapat beberapa kejadian di dalam sel termasuk replikasi kromosom dan sintesis dinding sel untuk perpanjangan sel. Pada dasarnya pembelahan sel dimulai setelah pembelahan kromosom. Namun pembelahan sel dapat dimulai tanpa menunggu selesainya pembelahan kromosom. Lokasi pembelahan pada dinding sel bukan di sembarang tempat. Hal ini ditunjukkan oleh adanya mesosom yang berindikasi pada lokasi atau tempat pembelahan berlangsung. 

Pembelahan biner sel bakteri Staphylococcus aureus

            Pada bakteri Enterococcus hirae pembelahan sel dimulai dari pembelahan kromosom (replikasi). Dua pita DNA pada kromosom bakteri mengalami pemutusan ikatan pada lokasi yang disebut origin of replication. Dengan putusnya ikatan antarbasa mengakibatkan enzim polimerase bekerja menyintesis pasangan baru untuk masing-masing pita DNA. Selama proses replikasi dinding sel bakteri E. hirae mempersiapkan diri untuk pembelahan dinding sel.

Secara kronologis pembelahan dinding sel pada E. hirae adalah sebagai berikut. Terjadi penetrasi sentripetal dinding sel dari 2 arah berlawanan pada pita dinding sel (pita ekuatorial), sehingga menghasilkan celah atau noktah dinding sel 2 pita dinding sel yang terpisah. Penetrasi noktah dinding sel ke arah dalam (70-80 nm) diikuti sintesis dinding sel baru. Pita dinding sel terbelah menjadi 2 dinding sel anakan (sebagian). Penetrasi noktah dinding sel (diikuti sintesis dinding sel baru) semakin ke dalam sehingga 2 noktah dinding sel bertemu. Ketika 2 noktah dinding sel bertemu, dinding sel memisah, terjadi pembelahan sel sempurna.

Pertumbuhan Mikroba 

1.      Kurva pertumbuhan mikroba

Suatu bakteri yang dimasukkan ke dalam medium baru yang sesuai akan  tumbuh memperbanyak diri. Jika pada waktu-waktu tertentu jumlah bakteri dihitung dan dibuat grafik hubungan antara jumlah bakteri dengan waktu maka akan diperoleh suatu grafik atau kurva pertumbuhan. Hubungan antara jumlah sel dengan waktu pertumbuhan dapat dinyatakan dalam Kurva Pertumbuhan

Pertumbuhan populasi mikroba dibedakan menjadi dua yaitu biakan sistem

tertutup (batch culture) dan biakan sistem terbuka (continous culture). 

a.    Biakan sistem tertutup (batch culture)

Pada biakan sistem tertutup, pengamatan jumlah sel dalam waktu yang cukup lama akan memberikan gambaran berdasarkan kurva pertumbuhan bahwa terdapat fase-fase pertumbuhan. Fase pertumbuhan dimulai pada fase permulaan, fase pertumbuhan yang dipercepat, fase pertumbuhan logaritma (eksponensial), fase pertumbuhan yang mulai dihambat, fase stasioner maksimum, fase kematian dipercepat, dan fase kematian logaritma.

1)      Fase Adaptasi

Ketika sel dalam fase statis dipindahkan ke media baru, sel akan melakukan proses adaptasi. Proses adaptasi tersebut meliputi sintesis enzim baru yang sesuai dengan medianya dan pemulihan terhadap metabolit yang bersifat toksik (misalnya asam, alkohol, dan basa) pada waktu di media lama.

Pada fase adaptasi tidak dijumpai pertambahan jumlah sel. Akan tetapi, terjadi pertambahan volume sel, karena pada fase statis biasanya sel melakukan pengecilan ukuran sel. Akan tetapi, fase adaptasi dapat dihindari (langsung ke fase perbanyakan), jika sel di media lama dalam kondisi fase perbanyakan dan dipindah ke media baru yang sama komposisinya dengan media lama.

2)      Fase Perbanyakan

Setelah sel memperoleh kondisi ideal dalam pertumbuhannya, sel melakukan pembelahan. Karena pembelahan sel merupakan persamaan eksponensial, maka fase tersebut disebut fase eksponensial. Pada fase perbanyakan jumlah sel meningkat sampai pada batas tertentu (tidak terdapat pertambahan bersih jumlah sel), sehingga memasuki fase statis.

Pada fase perbanyakan sel bakteri bertambah mengikuti pola atau persamaan eksponensial, yaitu Nt=No2ⁿ. Di mana Nt adalah populasi bakteri pada waktu ke-t; No adalah populasi awal bakteri, dan n adalah jumlah generasi.

Secara praktek kita dapat mengubah persamaan di atas dengan persamaan logaritmik, yaitu log₁₀Nt= log₁₀No + log₁₀2ⁿ. Dengan demikian kita dapat menentukan jumlah generasi (n) = 3.32[log₁₀Nt - log₁₀No].

Setelah menentukan jumlah generasi, maka kita dapat menentukan laju pertumbuhan (k) = n/t = (3.32[log₁₀Nt - log₁₀No])/t. Waktu generasi juga dapat kita hitung (tgen) = 1/k = t/n = t/(3.32[log₁₀Nt - log₁₀No]).

Pada fase perbanyakan sel melakukan konsumsi nutrien dan proses fisiologis lainnya. Pada fase ini produk senyawa yang diinginkan oleh manusia terbentuk, karena senyawa tersebut merupakan senyawa yang disekresi oleh sel bakteri. Beberapa senyawa yang diinginkan pada fase perbanyakan adalah etanol, asam laktat dan asam organik lainnya, asam amino, asam lemak, dan lainnya.

3)      Fase Statis

Alasan bakteri tidak melakukan pembelahan sel pada fase statis bermacam-macam. Beberapa alasan yang dapat dikemukaan adalah nutrien habis, akumulasi metabolit toksik (misalnya alkohol, asam, dan basa), penurunan kadar oksigen, dan penurunan nilai aw (ketersediaan air). Untuk kasus kedua dijumpai pada fermentasi alkohol dan asam laktat, untuk kasus ketiga dijumpai pada bakteri aerob, dan untuk kasus keempat dijumpai pada fungi.

Pada fase statis biasanya sel melakukan adaptasi terhadap kondisi yang kurang menguntungkan. Adaptasi itu dapat menghasilkan senyawa yang diinginkan manusia misalnya antibiotika dan antioksidan4).

4)      Fase Kematian

Penyebab utama kematian adalah autolisis sel dan penurunan energi seluler. Beberapa bakteri hanya mampu bertahan beberapa jam selama fase statis dan akhirnya masuk ke fase kematian, sedangkan ada bakteri yang mampu bertahan sampai harian bahkan mingguan pada fase statis dan akhirnya masuk ke fase kematian. Beberapa bakteri bahkan mampu bertahan sampai puluhan tahun sebelum mati dengan mengubah sel menjadi spora

Untuk lebih jelas bisa dilihat pada tabel

Fase lag	Fase logaritma / eksponential	Fase pertumbuhan stasioner/seimbang/maksimum	Fase kematian
•         Tidak ada pertambahan populasi •         Kecepatan pertumbuhan nol/lebih dari nol tetapi belum mencapai maksimum •         Fase adaptasi terhadap lingkungan baru •         Sel bakteri memerlukan bahan-bahan penting atau enzim enzim yang perlu disintesis sehingga substransi interselular bertambah •         Sel mengalami perubahan dalam komposisi kimiawi dan bertambah ukurannya	•         Aktivitas metabolik konstan •         Fase ini dimulai jika kecepatan pertumbuhan mencapai maksimum •         Keadaan pertumbuhan seimbang •         Massa dan jumlah sel bertambah secara eksponential dengan laju/ waktu generasi konstan •         Biakan dalam keadaan paling homogen dengan sel-sel yang semuanya tumbuh pada kecepatan dan interval yang sama	•         Fase dengan kecepatan pertumbuhan yang stabil •         Beberapa sel mati sedangkan yang lainnya tumbuh dan membelah •         Fase maksimum dikarenakan : –      Kekurangan nutrien Akumulasi hasil metabolisme akhir	•         Kecepatan pertumbuhan terus berkurang •         Kematian sel bakteri •         Sel bakteri yang mati lebih cepat dari pada terbentuknya sel-sel baru

Analisis Pertumbuhan Eksponensial

Untuk menganalisis pertumbuhan eksponensial dapat menggunakan grafik

pertumbuhan atau dengan perhitungan secara matematis. Rumus

matematika pertumbuhan menggunakan persamaan diferensial:

dX / dt = μX         (1)

X: jumlah sel / komponen sel spesifik (protein)

μ: konstanta kecepatan pertumbuhan

Dalam bentuk logaritma dengan bilangan dasar e, rumus

yang menggambarkan aktivitas populasi mikrobia dalam biakan sistem

tertutup adalah:

ln X = ln X0 + μ(t)         (2)

X0: jumlah sel pada waktu nol, X: jumlah sel pada waktu t, t: waktu

pertumbuhan diamati.

Dalam bentuk antilogaritma menjadi:

X = X0eμt (3)

Untuk memperkirakan kerapatan populasi pada waktu yang akan datang

dengan  μ sebagai konstante pertumbuhan yang berlaku. Parameter penting

untuk konstante pertumbuhan populasi secara eksponensial adalah waktu

generasi (waktu penggandaan). Penggandaan populasi terjadi saat X / X0

=2, sehingga rumus (3) menjadi:

2 =  eμ (t generasi)            (4)

Dalam bentuk logaritma dengan bilangan dasar e:

μ = ln 2 / t generasi = 0,693 / t generasi                (5)

Waktu generasi (t generasi) dapat digunakan untuk mengetahui parameter

lain, seperti

k ( konstante kecepatan pertumbuhan) sebagai berikut:

k = 1 / t generasi                        (6)

Untuk biakan sistem tertutup, kombinasi persamaan 5 dan 6 menunjukkan

bahwa 2

konstante kecepatan pertumbuhan μ dan k saling berhubungan:

μ = 0,693 k                                (7)

μ dan k, keduanya menggambarkan proses pertumbuhan yang sama dari

peningkatan

populasi secara eksponensial. Perbedaan diantaranya adalah, μ merupakan

konstante kecepatan pertumbuhan yang berlaku, yang digunakan untuk

memperkirakan kecepatan pertumbuhan populasi dari masing-masing

aktivitas sel individual dan dapat digunakan untuk mengetahui dinamika

pertumbuhan secara teoritis, sedang k adalah nilai rata-rata populasi pada

periode waktu terbatas, yang menggambarkan asumsi rata-rata

pertumbuhan populasi.

Contoh perhitungan k

Bilangan dasar yang digunakan untuk kerapatan populasi sel adalah 10,

sehingga persamaan (3) apabila dirubah menjadi bentuk logaritma

berdasarkan

bilangan 10 (log 10) dan k disubstitusi dengan μ , rumusnya menjadi:

k = log10 Xt – X0

          0,301 t

Contoh 1:  X0 = 1000 = 103

 , log10 dari 1000 = 3

Xt = 100.000 = 105

 , log 10 dari 100.000 = 5

t   = 4 jam

k = (5-3) / (0,301 x 4) = 2/1,204 = 1,66 generasi / jam

waktu generasi (t generasi) = 0,60 jam = 36 menit

Contoh 2:  X0 = 1000 = 103

 , log10 dari 1000 = 3 Xt = 100.000.000 = 108

 , log 10 dari 100.000.000 = 8

t   = 120 jam

k = (8-3) / (0,301 x 120) = 5/36,12 = 0,138 generasi / jam

waktu generasi (t generasi) = 7,2 jam = 430 menit

Pertumbuhan Diauxic

Pertumbuhan diauxic terjadi ketika bakteri dihadapkan pada dua sumber karbon yang berbeda dan mampu menggunakan kedua sumber karbon tersebut. Misalnya E. coli ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa dan laktosa (Gambar 4.7). E. coli memanfaatkan glukosa, karena sel telah memiliki enzim pendegradasi glukosa (enzim struktural). Glukosa sendiri menghambat sintesis enzim pemecah laktosa. Ketika glukosa habis, sel masuk fase statis dan menyintesis enzim yang mampu menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Ketika glukosa tersedia di media, sel memasuki fase perbanyakan kembali.

Rhizobium juga menunjukkan pertumbuhan diauxic ketika pada media diintroduksi 2 sumber karbon, yaitu suksinat dan glukosa. Rhizobium memanfaatkan suksinat dulu, kemudian glukosa. Mengapa Rhizobium lebih memanfaatkan suksinat bukan glukosa? Hal ini karena Rhizobium merupakan bakteri simbion. Secara alami bakteri simbion biasanya memerlukan triosa atau tetrosa yang dihasilkan dari siklus asam sitrat (Krebs) yang dihasilkan oleh inangnya daripada heksosa.

a.    Biakan Sistem Terbuka (Continuous culture) dalam Khemostat

Di dalam sistem ini, sel dapat dipertahankan terus menerus pada fase pertumbuhan eksponensial atau fase pertumbuhan logaritma.  Continuous culture mempunyai ciri ukuran populasi dan kecepatan pertumbuhan dapat diatur pada nilai konstan menggunakan khemostat. Untuk mengatur proses di dalam khemostat, diatur kecepatan aliran medium dan kadar substrat (nutrien pembatas). Sebagai nutrien pembatas dapat menggunakan sumber C (karbon), sumber N atau faktor tumbuh.

Pada sistem ini , ada aliran keluar untuk mempertahankan volume biakan dalam khemostat sehingga tetap konstan (misal V ml). Jika aliran masuk ke dalam tabung biakan adalah W ml/jam, maka kecepatan pengenceran kultur adalah D = W/V per jam. D disebut sebagai kecepatan pengenceran (dilution rate). Populasi sel dalam tabung biakan dipengaruhi oleh peningkatan populasi sebagai hasil pertumbuhan dan pengenceran kadar sel sebagai akibat penambahan medium baru dan pelimpahan aliran keluar tabung biakan. Kecepatan pertumbuhannya dirumuskan sebagai berikut:

dX/dt = μ X – DX = (μ - D) X.

Pada keadaan mantap (steady state), maka μ = D, sehingga dX/dt = 0.

Dengan sistem ini sel seolah-olah dibuat dalam keadaan setengah kelaparan, dengan nutreian pembatas. Kadar nutrien yang rendah menyebabkan kecepatan pertumbuhan berbanding lurus dengan kadar nutrien atau substrat tersebut, sehingga kecepatan pertumbuhan adalah sebagai fungsi konsentrasi nutrien, dengan persamaan:

μ = μmax S / (Ks + S)

μmax: kecepatan pertumbuhan pada keadaan nutrien berlebihan

S     : konstante nutrien

Ks   : konstante pada konsentrasi nutrien saat μ = ½ μmax

1.      Cara menghitung pertumbuhan mikroba

Pertumbuhan pada mikroba,contohnya bakteri didefinisikan dengan pertambahan berat sel. Karena berat sel relatif sama, maka pertumbuhan dapat didefinisikan sebagai pertambahan jumlah sel. Terdapat berbagai metode dalam mengukur pertumbuhan sel bakteri. Perhitungan sel bakteri terdiri atas 2 cara, yaitu perhitungan langsung dan tidak langsung. Perhitungan langsung meliputi metode turbidimetri, total count, dan berat kering. Perhitungan tidak langsung yaitu viable count.

a)      Metode Turbidimetri

Secara rutin jumlah sel bakteri dapat dihitung dengan cara mengetahui kekeruhan (turbiditas) kultur. Semakin keruh suatu kultur, semakin banyak jumlah selnya. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah, jika cahaya mengenai sel, maka sebagian cahaya diserap dan sebagian cahaya diteruskan. Jumlah cahaya yang diserap proposional (berbanding lurus) dengan jumlah sel bakteri. Atau jumlah cahaya yang diteruskan berbanding terbalik dengan jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel, semakin sedikit cahaya yang diteruskan.

Lebar wadah atau kuvet. Jika dikali log10, maka log I/I₀ = -xl. Karena log I/I₀ = OD=absorbansi cahaya, maka diperoleh persamaan  OD=A= xl. Metode ini mempunyai kelemahan, yaitu tidak dapat membedakan antara sel mati dan sel hidup.

 

 

a)      Metode Total Count

Total count memerlukan mikroskop dan wadah yang diketahui volumenya. Jika setetes kultur dimasukkan ke dalam wadah (misalnya hemasitometer) yang telah diketahui volumenya, maka jumlah sel dapat dihitung (Gambar 4.4). Akan tetapi, cara ini memiliki keterbatasan, yaitu tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan tidak dapat digunakanpada jumlah sel yang sangat sedikit (kurang dari 10⁶ sel/ml).

Metode yang lebih memuaskan dalam mengukur jumlah sel adalah Elektronic Total Count. Jika medan listrik mengenai sel hidup, maka timbul kejutan listrik. Akan tetapi, jika medan listrik mengenai sel mati, maka tidak timbul kejutan listrik. Semakin banyak kejutan listrik, semakin banyak pula jumlah sel yang hidup.

a)      Metode Berat Kering

Cara yang paling cepat mengukur jumlah sel adalah metode berat kering. Metode ini relatif mudah dilakukan, yaitu kultur disaring atau disentrifugasi, kemudian bagian yang tersaring atau yang mengendap hasil sentrifugasi dikeringkan. Pada metode ini juga tidak dapat membedakan sel yang hidup dan yang mati. Akan tetapi, keterbatasan itu tidak menutup manfaat metode ini dalam hal mengukur efisiensi fermentasi, karena pertumbuhan diukur dengan satuan berat, sehingga dapat diperhitungkan dengan parameter konsumsi substrat dan produksi senyawa yang diinginkan.

b)      Metode Viable Count

Metode viable count sering disebut dengan metode total plate count. Kultur diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi 1 koloni beberapa saat berikutnya biasanya 12-4 jam (Gambar 4.5). Akan tetapi, cara ini memiliki keterbatasan, yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya

(kemungkinan besar 1 koloni dapat berasal dari lebih dari 2 sel) dan tidakdapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat.

Pada metode ini yang perlu diperhatikan adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap gagal. Misalnya cawan yang dapat dihitung jumlah selnya adalah yang mempunyai jumlah sel sekitar 2-4 untuk sampel pengenceran (10^-x), 20-40 untuk sampel pengenceran (10^-(x+1)), dan 200-400 untuk sampel pengenceran (10^-(x+2)).